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            細菌培養

            發布時間:2021-04-09 17:38:29

            (一) 病料采集和運送 對動物進行病原菌檢疫,病料的采集和運送是否得當,是關系到能否分離到病原菌的關鍵。首先充分了解各種病原菌(目的菌)在被檢動物體內及其分泌物和排泄物中的分布情況,不同的病原菌在患病動物體內分布情況不同,即使是同一種病原菌,在病的不同時期和不同的病型中分布也不同。在采取病料前必須對被檢動物可能患有何種疫病作出初步診斷。采取病料所用器械和宣傳品器都應事先消毒,確保無毒,采樣時應無菌操作。如果動物已死亡,取樣應注意以下幾點:⑴ 對急性死亡的動物,從耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片,染色鏡檢,在排除炭疽后方能剖檢取樣;⑵ 采取病料時間,原則是越早越好,夏季要在動物死亡后2小時內采取病料;⑶ 為了提高病原微生物的陽性分離率,采取的病料要盡量可能齊全,除了內臟、淋巴結和局部病變組織外,還應采取腦組織和骨髓,以防遺漏;⑷ 認真填寫好病料送檢單和剖檢病理變化記錄。下面介紹病料的采取方法。


            1. 膿汁 先將表面流水線,然后以滅菌注射器或吸管抽取深部的濃汁;若是開口化膿灶或皮膚、粘膜表面化膿,可用滅菌棉拭子浸沾膿汁后,放入試管中。


            2. 內臟器官 采取心、肺、肝、脾、腎等有病變的組織及其淋巴結,無病變時也要采取,無菌剪取1-2cm大的方塊,分別裝入滅菌容器內。


            3. 血液 要全血時,無菌采取血液10m,立即注入盛有含0.5%肝素溶液0.1ml或5%檸檬酸鈉液1ml的滅菌試管內,并立即混合均勻。要分離血清時,將無菌采取的血液直接注入滅菌試管,待血液自然凝固后分離血清。從尸體采取血液時,可用滅菌注射器或吸管從右心房抽取。


            4. 皮膚和粘膜 采取病變局部的皮膚和粘膜及其所屬淋巴結,放入甘油鹽水溶液中。


            5. 腦和脊髓 無菌采取腦的脊髓約1-2cm大的方塊,放入甘油鹽水溶液中。


            6. 膽汁 用滅菌注射器抽出后放入滅菌試管中。


            7. 腸和胃 剪取有病變的部位一段或一塊。也可將腸管一段(約6-8cm)用線扎緊兩端后剪下送往實驗室。


            8. 糞便 可用棉拭子插入肛門沾取,或撲殺病畜后由腸管采取,立即放低溫條件下保存。


            9. 乳汁 先用消毒藥液洗凈乳頭及其附近,棄去最初擠出的幾滴乳汁,然后采取乳汁約10ml放入滅菌試管內。


            10. 流產胎兒 可將整個胎兒用塑料薄膜包緊,裝入箱中送檢。


            11. 小動物、禽和魚等可按上述流產胎兒方式整體送檢。在距離實驗室很近,又有隔離運輸條件時,也可將發病小動物直接送檢。


            (二) 病料的處理 采集的病料,在接種培養前,應對其性狀進行觀察,例如:是否膿性帶血或腐敗,有何異味,并作記錄。各種病料在分離培養前均應制備一張涂片,作革蘭氏染色、鏡檢,以了解細菌的形態、染色特性,并大致估計其含菌量。通過肉眼觀察和顯微鏡下看到的結果,對病料中可能含有的病原菌作最初步的估價。


            如果病料是病變組織,又是用無菌方法采集的,在接種前一般無需作特別處理。但如果病料被雜菌污染嚴重,則需根據要分離的病原菌的特性,采用一些對病原菌無害,但對雜菌有殺滅或抑制作用的方法,以抑制雜菌生長。例如從糞便中分離沙門氏桿菌,可將糞合接種于亞硒酸鈉肉湯中,作增菌處理。在這種培養基中,其它雜菌被抑制,而沙門氏桿菌則能自由繁殖。又如,分離布魯氏桿菌、胎兒彎曲桿菌、炭疽桿菌、副結核桿菌可用選擇性抗菌瓊脂。分離鏈球菌和豬丹毒桿菌用疊氮鈉結晶紫血瓊脂等。如果從腸道內容物或從污染有不產生芽胞的雜菌培養物中分離能形成芽胞的細菌(如魏氏梭菌、破傷風梭菌等),可將病料在80℃加熱15分鐘,以殺死不形成芽胞的雜菌,取此材料再接種培養基,即容易獲得純培養物。有些病料(如奶、尿等)含菌太少,則應先作集菌處理,然后接種,以提高檢出率,其集菌方法有離心法和過濾法。離心法取沉淀物作培養物;過濾后取沉積于濾板上表面的病料作培養。還有些細菌往往在細胞漿內集結成團,在它們所形成的病灶中含菌較少,遇到這種情況,可將病料組織磨碎,制成乳劑,加入酶、酸或堿,消化組織,使菌團散開,然后離心,收集沉淀物作培養(如從腸粘膜分離副結核桿菌即用此法)。


            (三) 細菌的分離與接種 培養細菌時,須將標本或細菌培養物接種于培養基上,常用接種方法有以下幾種。


            1. 平板劃線接種法 本法為最常用的分離培養細菌的方法,通過平板劃線后,可使細菌分散生長,形成單個菌落,有利于從含有多種細菌的標本中分離出目的菌。分離培養用的平板培養基應表面干燥,可于臨用前置37℃孵育箱內30分鐘,這樣表面即干燥有利于分離培養,又使培養基預溫,對培養某些較嬌弱的細菌有利。常用的平板劃線接種法有以下幾種。


            (1) 分區劃線法 此法多用于膿汁、糞便等含菌量較多的標本的分離。其方法是首先將接種環滅菌后,沾取標本均勻涂布于平板培養基邊緣一小部分(第一區),將接種環火焰滅菌,待冷卻后只通過第一區3-4次后連續劃線(為第二區),依次可共劃線3-5區,每一區細菌數可逐漸減少,直到分離出單個菌落為止。


            (2) 連續劃線法 該法多用于含菌數量較少的標本。其方法是首先用白金耳將標本均勻涂布于平板培養基邊緣一小部分,然后由此開始,在培養基表面自左向右連續劃線并逐漸向下移動,直到下邊緣。


            劃線接種時,盡可能作到直、密、勻,有效地利用培養基表面達到充分分離的目的。如果標本含菌較多,接種在強選擇培養基(如SS瓊脂)上時或標本含菌較少時,采用分區劃線法接種,接種環可一直劃完各區皿內,中間不必滅菌。


            2. 斜面接種法 采用該法目的是進行純培養。其方法是從平板分離培養物上用接種環挑取單個菌落或者是取純種,移種至斜面培養基上,先從斜面底部自下而上劃一條直線,再從底部開始向上劃曲線接種,盡可能密而勻,或者直接自下而上劃曲線接種。


            3. 傾注培養法 此法適用于乳汁和尿液等液體標本的細菌計數。其方法是取原標本或經適當稀釋(一般是10-1 -10-5倍稀釋)的標本1ml,置于直徑9cm無菌平皿內,傾入已融化并冷至50℃左右的培養基約15ml,立即混勻待凝固后倒置于37℃培養18-24小時,做菌落計數。


            4. 穿刺接種法 本法多用于雙糖、明膠等具有高層的培養基進行接種。方法是用接種針挑取菌落或培養物,由培養基中央直刺到距管底約0.3-0.5cm處。然后沿穿刺線退出接種針,若為雙糖等含高層斜面的培養基則光穿刺高層部分,退出接種針后直接曲線接種斜面部分。


            5. 液體接種法 本法多用于普通肉湯,蛋白胨、水等液體培養基的接種。其方法是接種環沾取菌種,傾斜液體培養基管,先在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體能淹沒接種物為準),然后再在液體中擺動2-3次接種環,塞好棉塞后輕輕混合即可。


            (四) 細菌的培養方法 根據培養細菌的目的和培養物的特性培養方法分為一般培養法、二氧化碳培養法和厭氧培養法三種。


            1. 一般培養法 將已接種過的培養基,置37℃培養箱內18-24小時,需氧菌和兼性厭氧菌即可于培養基上生長。少數生長緩慢的細菌,需培養3-7天直至一個月才能生長。為使培養箱內保持一定濕度,可在其內放置一杯水。培養時間較長的培養基,接種后應將試管口塞棉塞后用石臘凡士林封固,以防培養基干裂。


            2. 二氧化碳培養法 某些細菌,如牛流產布氏桿菌和胎兒弧菌等需要在含有10%二氧化碳的空氣中才能生長,尤其是初代分離培養要求更為嚴格。將已接種的培養基置于二氧化碳環境中進行培養的方法即二氧化碳培養法,常用方法有以下幾種:


            (1) 二氧化碳培養箱 可將已接種的培養基直接放入箱內孵育,即可獲得二氧化碳環境。


            (2) 燭缸法 將已接種的培養基,置于容量為2 000ml的磨口標本缸或干燥器內。缸蓋或缸口處均需涂以凡士林,然后點燃蠟燭直立置入缸中,密封缸蓋。待燃自行熄滅時,容器內約含5-10%的CO2 容器置37℃培養。


            (3) 重碳酸鈉-鹽酸法 每升容積的容器內,重碳酸鈉與鹽酸按0.4g與3.5ml的比例,分別將兩種藥各置一器皿內(如平皿內),連同器皿置于標本缸或干燥器內,蓋嚴后使容器傾斜,兩種藥品接觸后即可產生二氧化碳。


            3. 厭氧培養法 目前常用的厭氧培養方法有厭氧罐法、氣袋法及厭氧箱三種。


            (1) 厭氧罐法 是目前應用較廣泛的一種方法,共分為以下幾種。


            抽氣換氣法:該法適用于一般實驗室,其特點是較經濟并可迅速建立厭氧環境。標本接種后,將平板放入厭氧罐,擰緊蓋子,用真空泵抽出罐中空氣,使壓力真空表至-79.98KPa,停止抽氣,充入高純氮氣使壓力真空表指針回0位,連續反復3次,最后在罐內-79.98KPa的情況下,充入70%的N2 、20%H2 、10%CO2 (有人改用20%CO2 及80%H2 ,亦可獲得好結果)。罐中需放入冷催化劑鈀粒,可催化罐中殘余的O2 和H2 化合成水。同時罐中應放有美藍指示管,美藍在有氧的環境下呈藍色,無氧時為紅色。臨用前首先將美藍煮沸使變成無色,放入罐中先呈淺藍色,待罐中無氧環境形成,美藍即可持續無色。


            氣體發生袋法:氣體發生袋系由錫箔密封包裝,其中含有兩種藥片,一種為含枸椽酸和重碳酸氫鈉的藥片,另一種是含有硼氫化鈉的藥片。前者遇水放出二氧化碳,后者可釋放氫。使用時在袋的右上角剪一小口,灌進10ml蒸餾水,立即放入含有鈀粒、指示劑及平板培養基的厭氧罐中,擰緊蓋子經2-3分鐘后,可感到蓋子微熱并有少量水蒸氣出現。密封后1小時左右罐中的O2 的含量可低于<1%。


            (2) 氣袋法 此種方法不需要特殊設備,操作簡單,使用方便,不但實驗室中可用,而且外出采樣、現場接種也可用。原理與氣體發生袋完全相同,只是采用塑料袋代替了厭氧罐,氣袋為一透明而密閉的塑料袋,內裝有氣體發生安瓿、指示劑安瓿、含有催化劑的帶孔塑料管各一支。其操作方法為首先將接種的平板培養基放入袋中,用彈簧夾夾緊袋口,然后用手指壓碎氣體安瓿,20分鐘后再壓碎指示劑安瓿,如果指示劑不變藍色,說明袋內達到厭氧狀態,即可放入37℃進行培養。


            (3) 厭氧培養箱 使用之前須仔細檢查厭氧裝備有無漏氣等問題,以及催化劑、指示劑質量等。使用時嚴格遵守操作規程,保證箱內氣體比例合理。




            細胞培養常見問題及其解決


            1. 如何選用特殊細胞系培養基?




            培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長??傊?,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。


            2. 何時須更換培養基?


            視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。


            3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基?


            不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。


            4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類?


            不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。


            5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?


            FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。


            6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?


            一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統, 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養細胞。


            7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?


            HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。


            8. 細胞之接種密度為何?


            依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。


            9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?


            一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶, 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。


            10.冷凍管應如何解凍?


            取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。


            11. 細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO?


            除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。


            12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?


            一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。


            13.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?


            欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。


            14. 細胞冷凍培養基之成份為何?


            動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。


            15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?


            冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。


            16.冷凍保存細胞之方法?


            冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。


            冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。


            17. 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?


            冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。


            18.培養基中是否須添加抗生素?


            除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。


            19.應如何避免細胞污染?


            細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。


            20.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?


            原則上:直接滅菌后丟棄之。


            當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。

            高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。


            1.在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。


            2.分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。


            3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。


            4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。


            5.在無抗生素的培養基中培養細胞一代。


            6.重復步驟4。


            7.在無抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。


            21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?


            不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。


            22.支原體污染會對細胞培養有何影響?


            支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數, 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。


            23. 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?


            直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。


            24. CO2 培養箱之水盤如何保持清潔?


            定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去

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